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EdU细胞增殖检测试剂盒(647)

EdU细胞增殖检测试剂盒(647)

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产品价格 1350元 货号 RCF042
应用范围 细胞/组织增殖 规格 200T

EdU细胞增殖检测试剂盒说明书下载地址:

http://www.recordbio.com/EdU细胞增殖检测试剂盒‍(200T).pdf


EdU-647细胞增殖检测试剂盒

原理:EdU(5-ethynyl-2' -deoxyuridine),中文名为5-乙炔基-2' -脱氧尿苷,是一种胸腺嘧啶核苷类似物,其炔羟基团在天然化合物中很少见,在细胞增殖时能够替代胸苷(胸腺嘧啶脱氧核苷,thymidine) 插入正在复制的DNA分子中, EdU上的乙炔基能与荧光标记的小分子叠氮化物探针(如Azide Alexa Fluor 488等)通过一价铜离子催化发生共价反应,形成稳定的三唑环,该反应非常迅速,被称作点击反应(Click reaction),从而可以进行高效快速的检测细胞增殖,特别是可以有效地检测处于S期的细胞百分数。

与传统的免疫荧光染色(BrdU)检测方法相比, EdU只有BrdU抗体大小的1/500,在细胞内更容易扩散,不需要严格的样品变性(酸解、热解、酶解)处理,有效地避免了样品损伤,有助于在组织、器官的整体水平上观测细胞增殖的真实情况,具有更高的灵敏度和更快的检测速度。

产品货号:RCF-042

规格:200T

有效期:12个月

试剂盒组成

货号Code

品名Product name

储存条件Storage condition

RCF042-1

PB 10mL

-20℃

RCF042-2

AC 1mL*2

-20℃

RCF042-3

CU 400μL

-20℃

RCF042-4

647色原50μL

-20℃

RCF042-5

100mg/mL EdU母液 100μL

-20℃

备注:AC为粉剂,使用之前需要加入1mL纯水,充分溶解之后再使用,AC容易氧化失效,不使用时放入冰箱-20度保存,如发现变色,需更换新鲜试剂。

实验流程

1.样本处理

1.1动物实验

1.1.1动物EdU注射

对于小鼠,可以按照10-200mg/kg的用量,把EdU用PBS配制成一定浓度,腹腔注射、特定组织或器官局部注射或者加入饮用水中。具体用量跟所用动物的种类、体重和使用方式有关,可以参考相关文献,因此初次使用时建议对EdU的使用浓度进行一定的摸索,或者直接使用50mg/kg的浓度进行测试。

注射方式:依据客户实验而定,如腹腔注射,皮下注射,肌肉注射,尾静脉注射等,其中以腹腔注射为多。

6小时后或根据特定实验确定适当的时间后,快速处死小鼠,取出所需组织,按照常规步骤制作冰冻切片或石蜡切片。EdU标记的时候也可参考相关文献自行调整。

建议任何实验均可取小肠组织检测细胞增殖情况,小肠上皮组织细胞增殖快,成年小鼠EdU注射6小时后即可检测到阳性信息,可用作阳性对照进行预实验。

1.1.2切片处理

切片前处理:组织器官最好进行清洗,以去除血液、组织中残留的EdU,降低背景。

切片厚度:3-10μm为宜,切片过厚可能会影响切片背景及染色效率。

切片后处理:

石蜡切片脱蜡:二甲苯脱蜡2次,15分钟/次,梯度乙醇(100%,95%,85%,75%)各一次,5分钟/次,去离子水洗脱1次。

冰冻切片处理:室温放置30分钟后,固定10分钟,PBS清洗3次,每次5分钟。

1.2细胞实验

1.2.1细胞EdU标记

用细胞完全培养基和EdU母液按8000:1的比例稀释,制备适量50μM的EdU培养基;

每孔加入适量50μM的EdU培养基孵育2小时,弃培养基(最佳孵育时间一般为细胞周期的1/10),EdU培养基和EdU反应液孵育体积可参考下表;

3)PBS清洗细胞3次,每次5分钟



96孔板

48孔板

24孔板

12孔板

6孔板

5.5cm小皿

EdU培养基

100μL

200μL

300μL

500μL

1mL

2mL

EdU反应液

100μL

200μL

300μL

500μL

1mL

2mL


1.2.2细胞固定通透

1)每孔加入细胞固定液(含4%的多聚甲醛的PBS)室温孵育15分钟,弃固定液,PBS 清洗3次,每次5 分钟。;

2)每孔加入渗透剂(0.5% TritonX-100 的 PBS)脱色摇床孵育 15 分钟;PBS 清洗3次,每次5 分钟。

2.EdU反应

按照PB:CU:AC:647色原=860:40:100:5的比列配制EdU反应液(反应液现配现用)。

每个样本滴加50-100μL的EdU染色反应液(反应液均匀覆盖样本),室温避光孵育15-60分钟,弃染色反应液,PBS冲洗3次,每次5分钟。

3.DAPI染色

每个样本加入50-100μL DAPI染色液,染色15分钟,PBS清洗3次,每次5分钟。

4.图像拍照

染色完成后建议立刻观察,使用荧光显微镜、共聚焦显微镜或者全片扫描仪进行采集图像,染色完玻片避光4℃保存。


以上是50mg/kg标记小鼠6小时的染色图像



实验前须知

EdU 的分子量为 252.23,易溶于水,PBS,生理盐水。

对于动物实验,建议将EdU粉末溶解于DMSO配制成100mg/ml的母液。

EdU 建议初始给药量为 50mg/kg(50μg/g),稀释浓度为 0.5~1mg/mL。小鼠体重20g,需要注射1mg,以1mg/mL计算,需要注射1mL。

Edu

0.1mg

1mg

2mg

10mg

PBS

100μL

1mL

2mL

10mL

对于细胞实验, EdU母液质量浓度为100mg/mL,转化为物质的量浓度为400mM,建议将EdU母液稀释成50mM储存液,推荐的EdU工作浓度为10μM。




文章引用试剂盒/方法:Staining of EdU was performed using a EdU cell proliferation Assay kit ( Recordbio Biological Technology, Shanghai, China) based on the click chemistry technology according to the manufacture’s instruction.






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