Tunel试剂盒（Cy3）
原理: 细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测，可以发现180-200bp的DNA
ladder。基因组DNA断裂时，暴露的3'-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal
Deoxynucleotidyl Transferase,TdT)的催化下加上绿色FITC或Alexa488/红色荧光探针Cy3(Cyanine 3)标记的dUTP，从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测，这就是TUNEL(TdT-mediated dUTP
Nick-End
Labeling)法检测细胞凋亡的原理
试剂盒组成：
组
分 | RC-01 (20 T)
| RC-02 (50 T) | RC-03 (100 T) |
荧光反应液 | 1 ml | 2.5 ml | 5 ml |
TdT酶 | 20μl | 50 μl | 100μl |
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保存条件：-20度
石蜡切片荧光Tunel实验流程
一、实验器材及试剂
实验器材
名称 | 厂家 | 型号 |
病理切片机 | 上海徕卡仪器有限公司 | RM2235 |
组织摊片机 | 浙江省金华市华速科技有限公司 | HS1125 |
烤箱 | 绍兴市苏珀仪器有限公司 | 303-ISB |
载玻片 | 江苏世泰实验器材有限公司 | 188105 |
盖玻片 | 江苏世泰实验器材有限公司 | 10212424C |
微波炉 | 格兰仕微波炉电器有限公司 | P70D20TL-P4 |
脱色摇床 | SCILOGEN,LLC | SK-0180-E |
涡旋混合器 | 江苏朗越 | XH-C |
移液枪 | Dragon | YE6K809531/YE6L882023 |
组化笔 | Gene tech | GT1001 |
倒置荧光显微镜 | 日本尼康 | Nikon Eclipse CI-S |
成像系统 | 日本尼康 | Nikon DS-U3 |
主要实验试剂
试剂 | 厂家 | 货号 |
无水乙醇 | 国药集团化学试剂有限公司 |
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二甲苯 | 国药集团化学试剂有限公司 |
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PBS缓冲液 20X柠檬酸修复液（PH6.0） | 茹创生物 茹创生物 | RC035 RC015 |
10*蛋白酶K储存液 | 茹创生物 |
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破膜液 | 茹创生物 |
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DAPI | 茹创生物 |
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抗荧光淬灭封片剂 | 茹创生物 |
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Tunel试剂盒 | 茹创生物 | RC-012 |
石蜡切片荧光tunel实验步骤
石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min，取出置于通风厨内等酒精晾干后放入自来水中稍洗，蒸馏水洗。(冬天应提高脱蜡温度或适当延长脱蜡时间）
通透：PH6.0柠檬酸修复液中火修复8min ，室温冷却，用免疫组化笔划圈，之后纯水洗三次(重要)。（通透方式有多钟：1蛋白酶消化，2tritonx100通透剂通透，柠檬酸修复）
配试剂工作液以及孵育：荧光反应液和TdT酶按50:1比例混合，此液为tunel工作液，，将tunel工作液加入到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温箱孵育1到2小时，湿盒内加少量水保持湿度。
DAPI复染细胞核：切片用PBS（PH7.4）洗涤3次，每次5min。去除PBS后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。
6、封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。
7、 镜检拍照：切片于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像。（紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm；FITC绿光激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm；CY3红光激发波长510-560，发射波长590nm）
石蜡切片荧光tunel结果判读
DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色，试剂盒为FITC/Alexa488/cy3标记，阳性凋亡细胞核为绿色/绿色/红色
